Os métodos tradicionais de identificação de microrganismos dependem fortemente da morfologia, fisiologia, patologia e testes bioquímicos, sendo demorados, trabalhosos e muitas vezes produzem resultados com pouca acurácia. Os avanços das tecnologias de análise de DNA nas últimas décadas facilitaram a identificação microbiana e promoveram o aumento da pesquisa sobre os microrganismos.
PCR baseada em elementos repetitivos (rep-PCR)
Essa técnica se baseia na análise de padrões de bandas geradas por PCR a partir de sequências de DNA altamente conservadas que se repetem no genoma de bactérias. Esses padrões podem podem ser examinados como se fossem "impressões digitais".
Foram identificadas três famílias de sequências repetitivas:
sequências REP (Repetitive Extragenic Palindromic elements) com 35-40 pares de bases, as quais são conservadas em várias espécies bacterianas;
sequências ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus elements) de 124-127 pares de bases, as quais contêm um elemento repetitivo central invertido altamente conservado e que estão localizados nas regiões extragênicas do genoma bacteriano;
elemento BOX de 154 pares de bases.
💡 E os fungos? Embora os primers rep-PCR tenham sido desenvolvidos para elementos repetitivos em genomas procarióticos, esses primers tem sido também aplicados com sucesso para a análise de eucariotos.
Aplicações da técnica:
Estudo de clonalidade;
Vantagens da técnica:
Rápida;
Econômica;
Poder de discriminação melhor do que a análise de restrição de gene marcador.
Limitações da técnica:
Não realiza a identificação de isolados não identificados.
Análise do gene do 16S rRNA
Essa técnica se baseia na amplificação por PCR e sequenciamento Sanger do gene marcador codificador do 16S rRNA procariótico, seguida da comparação da sequência obtida com a sequência de estirpes tipo ou de estirpes de referência.
Apesar de ter sido muito utilizado no passado para se identificar espécies bacterianas, hoje é bem conhecido que o gene do 16S rRNA apresenta resolução somente até o nível de gênero. A sequência de DNA do gene tem cerca de 1.550 pb de comprimento, e é recomendado que pelo menos 1.300 pb sejam utilizados para a análise de isolados.
Somente bancos de sequências curados devem ser utilizados para identificar as sequências mais semelhantes para realizar a comparação, a exemplo do EzBioCloud. O BLAST deve ser evitado para calcular valores de identidade entre as sequências de 16S rRNA obtidas e a de estirpes de referência. Para alinhar as sequências recomenda-se usar um algoritmo de alinhamento global, e também dar preferência para aqueles desenvolvidos especificamente para considerar a estrutura secundária do RNA, por exemplo, o alinhador SINA.
💡 E os fungos? Para os fungos a análise é feita utilizando as sequências da região ITS (espaçador interno transcrito) ou do gene do 18S rRNA. O poder discriminatório dessas sequências é maior do que a análise do 16S rRNA bacteriano.
Vantagens da técnica:
Econômica;
Banco de dados de sequência acessível e vasto.
Limitações da técnica:
Resolução apenas até o nível de gênero para bactérias;
Árvores filogenéticas costumam apresentar baixo suporte;
Resultado enviesado em isolados com múltiplas cópias do gene.
Análise de sequências multilocus (MLSA)
Essa análise inclui a PCR e o sequenciamento Sanger de múltiplos genes marcadores (ou housekeeping) que estão localizados em múltiplos locus. Para bactérias, essa técnica apresenta um poder discriminatório bem maior do que somente a utilização do gene do 16S rRNA.
Entanto, apesar da análise de MLSA ser um método aceito e amplamente utilizado na taxonomia procariótica, não existe nenhuma recomendação geralmente aceita elaborada até agora, ou seja, existem diferentes maneiras de como o MLSA é realizado, existindo grande variação na seleção de genes, número de genes e o método de cálculo usado na comparação das sequências obtidas.
Vantagens da técnica:
Maior resolução em comparação com a análise de um gene único.
Limitações da técnica:
Resolução apenas até o nível de gênero para bactérias;
Não existe recomendação consenso de como realizar a análise;
Análise genômica
Essa análise é baseada no sequenciamento de nova geração (NGS, Next Generation Sequencing) de todo o contéudo de DNA bacteriano seguido da análise de índices de relação genômica geral (OGRI, overall genome relatedness index) estimadas com base, por exemplo, na identidade média de nucleotídeos (ANI) e na hibridização digital de DNA-DNA (dDDH). Para a comparação, múltiplos genomas bacterianos já estão prontamente disponíveis, incluindo material de estirpes tipo.
É consenso da comunidade científica que essa é de longe a técnica mais confiável para a identificação de uma espécie bacteriana, uma vez que:
a precisão dos testes fisiológicos e bioquímicos é afetada pela expressão diferencial de genes e também pela manipulação de bancada;
a análise de um ou poucos marcadores não apresenta resolução e suporte suficiente para a maioria dos casos, além disso, as bactérias podem conter multiplas cópias de genes marcadores, as quais são frequentemente diferentes dentro da mesma espécie, ou até mesmo dentro de um mesmo genoma;
as determinações do DDH experimental estão sujeitas a muitos erros de interpretação e não podem ser usadas para construir um banco de dados comparativo de forma incremental.
💡 E os fungos? Abordagens em nível de genoma inteiro estão ficando cada vez mais populares em busca de evitar a baixa resolução em estudos empregando marcadores únicos ou MLSA. Para isso, a análise da porcentagem de proteínas conservadas (POCP) do genoma parecer ser mais utilizada.
Vantagens da técnica:
Única capaz de identificar bactérias até o nível de espécie;
Também gera dados que podem ser utilizados para a identificação de genes de interesse e de capacidade metabólica.
Limitações da técnica:
Menos econômica quando comparada com outras técnicas;
Carência de algortimos e banco de dados para comparação de genomas de fungos.
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Fontes:
Van Belkum A et al. (1998) Short-sequence DNA repeats in prokaryotic genomes. Microbio Mole Biology Rev 62: 275-293. https://doi.org/10.1128/mmbr.62.2.275-293.1998
McDonald JG et al. (2000) Differentiation of Tilletia species by rep-PCR genomic fingerprinting. Plant Dis 84: 1121-1125. https://doi.org/10.1094/PDIS.2000.84.10.1121
Mehta YR et al. (2002) ERIC and REP-PCR banding patterns and sequence analysis of the internal transcribed spacer of rDNA of Stemphylium solani isolates from cotton. Cur Microbio 44: 323-328. https://doi.org/10.1007/s00284-001-0026-4
De Arruda MCC et al. (2003) Comparison of Crinipellis perniciosa isolates from Brazil by ERIC repetitive element sequence‐ based PCR genomic fingerprinting. Plant Patho 52: 236-244. https://doi.org/10.1046/j.1365-3059.2003.00819.x
Abdollahzadeh J et al. (2014) Efficiency of rep-PCR fingerprinting as a useful technique for molecular typing of plant pathogenic fungal species: Botryosphaeriaceae species as a case study. FEMS Microbio Letters 361: 144-157. https://doi.org/10.1111/1574-6968.12624
Acinas SG et al. (2004). Divergence and redundancy of 16S rRNA sequences in genomes with multiple rrn operons. Journal of Bacteriology, 186:2629-2635. https://doi.org/10.1128/JB.186.9.2629-2635.2004
Gevers D et al. (2005) Re-evaluating prokaryotic species. Nat Rev Microbiol 3:733–739. https://doi.org/10.1038/nrmicro1236
Auch AF (2010). Digital DNA-DNA hybridization for microbial species delineation by means of genome-to-genome sequence comparison. Stand Genomic Sci, 2:117-134. https://doi.org/10.4056/sigs.531120
Hayashi Sant’Anna F (2019). Genomic metrics made easy: what to do and where to go in the new era of bacterial taxonomy. Critical Reviews in Microbiology, 45:182-200. https://doi.org/10.1080/1040841x.2019.1569587
Lücking R et al. (2020) Unambiguous identification of fungi: where do we stand and how accurate and precise is fungal DNA barcoding? IMA Fungus 11, 14. https://doi.org/10.1186/s43008-020-00033-z
Glaeser SP, Kämpfer P. (2015) Multilocus sequence analysis (MLSA) in prokaryotic taxonomy. Syst Appl Microbiol, 38:237-45. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25959541