A utilização do 16S rRNA na identificação de bactérias.
A identificação de microrganismos é um fator importante em diversas áreas. Seja para o diagnóstico de uma doença, para controle de qualidade de produto industrial ou na caracterização da diversidade de uma amostra ambiental.
Existem diversos métodos de identificação que se baseiam em diferentes princípios de detecção, assim como cultivo, microscopia, potencial eletroquímico, análises moleculares (envolve detecção de ácidos nucleicos, ácidos graxos ou proteínas). A escolha depende dos objetivos da pesquisa.
A área clínica, por exemplo, pode requerer a identificação precisa de um microrganismo isolado até o nível de espécie, tendo em vista que a seleção de medicamentos muitas vezes depende dessa informação. Já na área ambiental, os métodos são mais focados no estudo de populações e na forma como elas interagem, não apenas em indivíduos isolados por cultivo. Para ambas as situações, existem métodos de identificação baseados na análise de DNA. Na área ambiental e industrial, tais métodos têm se tornado cada vez mais relevantes.
Por meio da metataxonômica (ou metabarcoding), por exemplo, é possível identificar microrganismos de maneira independente de cultivo em diversas amostras complexas, assim como água, solo, sedimentos, biofilmes, etc. Nesta técnica, o DNA total dos microrganismos de uma amostra é extraído antes da amplificação por PCR e sequenciamento de fragmentos de genes específicos: 16S rRNA para bactérias e ITS para fungos.
Tais genes são excelentes marcadores taxonômicos por possuírem sequências de DNA altamente conservadas entre diferentes microrganismos, permitindo inferências sobre as relações evolutivas e de parentesco.
E a identificação, afinal? Qual a relação com o 16S rRNA?
Ao identificar um microrganismo, geralmente queremos saber a qual espécie ele pertence. Porém, uma grande dificuldade na taxonomia microbiana, especialmente de bactérias, é definir o que é uma espécie. Atualmente, um dos conceitos predominantes é o filogenético (filogenia baseada em um ou poucos genes conservados), ou seja, baseado na análise de sequências de DNA.
Desde que o gene 16S rRNA foi proposto como molécula informacional, milhares de sequências são depositadas anualmente nos bancos de dados. Tamanho grau de informação permitiu que ampliássemos nossos conhecimentos sobre a taxonomia de bactérias e colaborou, juntamente com métodos clássicos e filogenômicos (filogenia baseada em centenas ou milhares de genes conservados) para a caracterização de novos microrganismos: estima-se que 600 novas espécies de bactérias são descritas todos os anos!
Mas, apesar dos avanços, sabemos que a análise do 16S rRNA apresenta limitações.
Em relação aos métodos de sequenciamento, precisamos ter em mente o tamanho dos fragmentos que serão sequenciados. Nem todas as técnicas são capazes de sequenciar o gene completo, que apresenta cerca de 1500 pb. Embora seja possível utilizar primers para regiões menores e específicas do gene que, sabidamente, são mais variáveis (existem 9 regiões hipervariáveis), sua resolução taxonômica não permite a identificação ao nível de espécie, mas de gêneros, assim como na metataxonômica que emprega o sequenciamento NGS (Next Generation Sequencing) para análise de amostras complexas.
Para a classificação precisa ao nível de gênero e estimativas ao nível de espécies em isolados bacterianos, uma alternativa é o sequenciamento completo do gene 16S rRNA por meio do método Sanger. Essa abordagem, inclusive, é capaz de identificar os polimorfismos que tanto dificultam a identificação nesse nível taxonômico, sendo útil para o emprego de análises filogenéticas abrangentes. Para a identificação precisa ao nível de espécies e linhagens, a alternativa cada vez mais empregada é o sequenciamento e a análise de genomas por NGS.
Mas estas não são as únicas opções. Pela abordagem metagenômica é possível sequenciar genomas e identificar até mesmo novas espécies em amostras complexas.
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